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17羥孕酮Elisa試劑盒HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)主要有4—氨基：耦聯(lián)底物對(duì)（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對(duì)（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存在下，4—氨基和經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收。
該耦聯(lián)色原底物對(duì)用于固相ELISA時(shí)，敏感性一般較低，反應(yīng)見(jiàn)光不穩(wěn)定，而且易發(fā)生多聚化，缺乏適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標(biāo)的酶法檢測(cè)應(yīng)用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標(biāo)記酶的均相酶免疫試驗(yàn)，可用甲醛終止反應(yīng)。但這種方法僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，其后也未見(jiàn)有其他實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用報(bào)道，可能還有其固有的缺陷。
4—氨基：耦聯(lián)底物對(duì)色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基以2 mmol／L，以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2），即可應(yīng)用；②終止液：未見(jiàn)報(bào)道；③測(cè)定波長(zhǎng)：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍(lán)色的吲達(dá)胺（indamine），zui大吸收波長(zhǎng)為590nm，見(jiàn)光不穩(wěn)定。用鹽酸或硫酸終止反應(yīng)后，pH應(yīng)為3．0左右，pH值的降低使顯色從紫藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{(lán)色，zui大吸收波長(zhǎng)從590nm變?yōu)?95nm，然而pH值的進(jìn)一步降低，將導(dǎo)致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯(lián)對(duì)在固相ELISA測(cè)定幾乎沒(méi)有應(yīng)用。
堿性磷酸酶（AP）
在17羥孕酮Elisa試劑盒測(cè)定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對(duì)硝基苯磷酸鹽。在堿性磷酸酶的作用下生成對(duì)硝基酚（），其在入＝405 nm處有zui大吸收.
由于堿性條件下的光吸收增強(qiáng)，并可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因?yàn)閱我掖及穼?duì)堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無(wú)機(jī)磷可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制堿性磷酸酶的活性，貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)由于非酶水解而產(chǎn)生硝基酚和磷酸鹽時(shí)即可出現(xiàn)這種情況，此時(shí)呈黃色。
因此，用于ELISA測(cè)定時(shí)，必須五色。的摩爾消光系數(shù)（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強(qiáng)度、蛋白含量，當(dāng)溫度從15~C升高至45℃時(shí)，在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。
在17羥孕酮Elisa試劑盒測(cè)定時(shí)，色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將以10 mmol／L的濃度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺緩沖液（pH 9．8），即可應(yīng)用；②終止液：0．5 mol／L碳酸鈉；③測(cè)定波長(zhǎng)：405nm。